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血管平滑肌细胞分离的过程?

归档日期:08-14       文本归类:多态性      文章编辑:爱尚语录

  解剖老鼠取出血管分离平滑肌细胞具体过程是什么样的?我是一个新手,怎么消毒、固定、解剖我都不太清楚。请各位提供一个详细的试验方案!谢谢!!...

  解剖老鼠取出血管分离平滑肌细胞具体过程是什么样的?我是一个新手,怎么消毒、固定、解剖我都不太清楚。请各位提供一个详细的试验方案!谢谢!!

  胎牛血清,DMEM,胰蛋白酶和异硫氰酸胍为GIBCO公司产品;抗平滑肌 Actin单克隆抗体和随机引物标记试剂盒为Promega公司产品;质粒PA-2.2由加洲大学Rubin教授惠赠;a-32PdCTP比活度?TBq/mmol为英国Amersham公司产品;硝酸纤维素膜为瑞典Pharmacia公司产品。

  1.2.1 取材:选重18~22g健康C57BL/6小鼠(转基因鼠和对照鼠)〔5],2.5%阿丁佛腹 腔注射麻醉后,摘眼球放血处死,然后将整个小鼠浸泡于75%乙醇3~5s,用组织剪刀逐层开胸,无菌条件下取出心脏和主动脉并移至含青霉素200U/mL,链霉素200mg/mL和Hanks 液内备用。

  1.2.2 原代培养与传代:用Hanks 液自左心室灌注冲洗心脏和主动脉3次,再用0.05%胰蛋白酶液冲洗三次。然后用眼科剪剪去主动脉表面的脂肪组织和心脏。将主动脉置于无血清的DMEM液中,浸泡10min。再置于含10% NCS DMEM中10min,在青霉素小瓶中剪碎,并用DMEM冲洗。静置5min,吸出悬浮组织及上清液,将沉淀组织块再次剪碎冲洗,静置5min,反复2~3次。用弯头吸管将组织块均匀地接种于25mL 培养瓶中,倒置。加入3mL含20% NCS的DMEM培养液,置于37℃ 含95%空气和5% CO2 培养箱培养4~5h。原位将培养瓶轻轻翻转,使贴壁的组织块浸泡在培养液中,静止培养3天。于第5~7天显微镜下观察,可见有梭形细胞沿组织块边缘生长,第10~14天左右长出成片致密的细胞。3周后细胞汇集成片即可传代。细胞长满后,倾去培养液,加入10% NCS DMEM 3mL,用吸管反复吹打,按所需比例接种到新培养瓶中继续培养。一般3~5天再传代。

  1.2.3 细胞冻存和复苏:取对数生长期细胞,在收集细胞24h前换液一次。按传代的方法消化细胞,加入20% NCS ,10% DMSO 的培养液一滴一滴加入离心管中,制成5×106细胞悬液,分装于若干个冻存管中,每个1.5mL。于4℃过夜,次晨用纱布将冻管包裹,以每分钟降1~2℃速度冷却至-25℃时,再以每分钟降5~10℃速度冷却至-70℃时,全部浸入液氮中储存。从液氮中取出冻存细胞,立即放入38~40℃水浴,并振荡使细胞快速解冻,移至含5mL 完全培养基的离心管。室温下1 000r/min离心10min,弃上清,加入新鲜的完全培养基,移至培养瓶中继续培养,以后每2~3天换液一次,待细胞长满后传代。

  1.2.4.3 Northern Blot检测: 取转基因鼠和正常对照鼠第6~8代细胞传代72h后改用0.4%血清(人和牛各半)的DMEM 培养液培养48h(使细胞处于汇合状态)。每组4瓶(75cm2/瓶),继续用10% NCS 的DMEM培养液培养48h。然后用0.01%胰酶消化,于4℃,1 000r/min,5min收集细胞,用10倍体积的PBS缓冲液洗涤细胞沉淀两次。然后按Chomczynski等〔6]方法提取总RNA。取总RNA 20mg在1.2%琼脂糖甲醛变性凝胶电泳,转移至硝酸纤维素膜上。用随机引物法标记人apo AI 2.2 kb PstI片断为探针进行Northern blot检测。

  原代细胞中有平滑肌细胞和非平滑肌细胞,传至第5~6代时,平滑肌细胞达95%以上。经台盘蓝染色检查活细胞达99%。镜下可见贴壁的细胞呈长梭型或梭型,细胞呈平行或放射状生长(图1)。

  培养的细胞经平滑肌肌动蛋白单克隆抗体(S-P法)免疫组化染色,可见细胞呈阳性反应(图2)。

  结果表明,转基因鼠主动脉平滑肌细胞中有人apo AI mRNA表达,而正常鼠则未检出(图3)。

  培养VSMC为研究各种因素对SMC的增殖,分化与动脉粥样硬化之间的关系提供了较好的实验方法。大动物主动脉SMC的培养一般采用酶消化法和贴块法〔3,4,7],而小鼠主动脉SMC的分离与培养较为困难,国内尚未见报道。本实验改进了贴块法,成功地分离和培养出小鼠主动脉SMC。经光镜,免疫组化检查证实为平滑肌细胞,Northern blot检测表明,转基因鼠主动脉平滑肌细胞中有人apoAI mRNA 表达,而正常鼠则未检出(图3)。

  小鼠主动脉由于标本细小,尤其是转基因小鼠,成本高,材料供给比较困难。不容易除去内膜和外膜。本实验采用先灌洗后取动脉标本的优点是因为动脉连接于心脏比较固定,有利于胰酶灌洗除去膜。此外,在培养液中,根据外膜比重低而平滑肌比重高的特点,将动脉剪成细胞小组织块,用培养液反复冲洗吸去悬浮组织以除去外膜。该方法具有简单,和成活率高的优点。本实验培养的SMC来源于转基因小鼠,高效表达人apoAI mRNA。这为进一步从细胞和分子水平研究apoAI基因表达在胆固醇代谢及动脉粥样硬化发生中的作用提供了较理想的细胞模型。

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