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噪声性听力损失易感性与GSTM1、GSTT1、MtDNA和CDH23基因多态性研

归档日期:08-14       文本归类:多态性      文章编辑:爱尚语录

  中山大学 硕士学位论文 噪声性听力损失易感性与GSTM1、GSTT1、MtDNA和CDH23基因多 态性研究 姓名:杨震宇 申请学位级别:硕士 专业:劳动卫生与环境卫生学 指导教师:刘移民 20060601

  噪声性听力损失易感性与GSTMl、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  噪声性听力损失(noise—induced hearing loss,NIHL)是最常见的职业性疾患。 NIHL与噪声暴露量呈正相关,噪声暴露强度越大,暴露时间越长,产生的听力

  上却存在很大的差异;或者产生相同严重程度的听力损失,易感个体与非易感个 体相比需要更少的噪声暴露量,说明NIHL存在明显的个体易感性差异。 造成NIHL的主要因素是噪声暴露量,然而有相当多的体内外因素可以影响 NIHL的严重程度,从而造成易感性表型的差异。某些可吸入性化学毒物,如甲 苯、一氧化碳与噪声有协同作用,可以加重NIHL;某些耳毒性药物如顺铂、氨 基甙类抗生素等亦有类似作用。而机体内在因素如低镁、低铁、高血脂等也会增 加个体对NIHL的易感性。遗传因素亦会影响个体对NIHL的易感性。基因是遗

  基金项目:广州市医药卫生科技重点攻关项目(2003A3403) 作者单位:1.中山大学公共卫生学院预防医学系,广东广州510080; 2.广州市职业病防治院,广东广州510620.

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  传信息的携带者,随着分子生物学技术在NIHL研究中的应用,近年己发现几种 与NIHL易感性相关的基因,如:谷胱甘肽硫转移酶基因(GSTMl、GSTTl)、 线粒体基因(MtDNA)、钙黏素23基因(CDH23)、质膜ca2+.ATP酶2突变 (Pmca2)、超氧化物歧化酶(Sodl)、谷胱甘肽过氧化物酶基因去除(GPxl)、 老年性耳聋基因(Ahl)和热休克蛋白(HSPs)基因等。 研究噪声性听力损失易感基因与NIHL的关系对于NIHL预防具有重要的意 义。如果能确认NIHL易感基因,就有可能在暴露于噪声环境之前将NIHL易感

  个体筛选出来,有效地减少NIHL的发生,达到一级预防的目的。本课题研究与

  NIHL相关的几个基因,为确定这几个基因与NIHL的关系提供一定的理论依据, 为NIHL的筛查提供有价值的遗传标记,并为研究其它易感基因提供一定的理论 基础和技术方法指导。

  PCR)技术,了解NIHL易感性与GSTMl、GSTTl、MtDNA和CDH23基因多态 性的关系。为NIHL易感个体的筛选提供基础资料,更好地预防NIHL的发生。

  选择噪声暴露强度在75~105dB的工人为研究对象,设计调查表逐个对研究

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTl、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  GSTMl、GSTTl、MtDNA和CDH23基因多态性检测 利用引物设计软件并参考文献分别设计GSTMl、GSTTl、MtDNA和CDH23

  基因相应位点的引物,进行PCR扩增。以Albumin为内对照,双重PCR方法扩

  增GSTMl和GSTTl基因,鉴定基因型;采用巢式PCR方法检测mtDNA4977缺

  失;常规PCR方法扩增CDH23基因,再分别进行限制性酶切反应判断 CDH23-rsl227049和CDH23一rsl227051位点基因型。

  数据处理与统计分析 应用SPSSll.0软件包进行统计分析,检验显著水平为0.05。噪声累积暴露

  量与NIHL的量效关系、基因型频率的组问比较用f检验;Logistic回归分析噪

  声累积暴露量与NIHL的关系:多因素Logistic回归分析方法对个体间年龄和累 积噪声暴露量等因素进行校正。

  研究对象的一般情况 本次研究共筛查出符合条件的对象254例,其中病例和对照各127例,年龄

  19.O~56.0(y),平均36.1±9.3(y):接噪工龄1~37(y),平均11.O±7.6 (Y);噪声暴露强度75.O~102.0(dB),平均90.7±8.4(dB);累积噪声 暴露量52.3~96.1(dB),平均79.6±8.5(dB)。病例组与对照组问年龄、 接噪工龄、噪声暴露强度、累积噪声暴露量差异不具有统计学意义。

  率,结果表明:随着累积噪声暴露量的增加,噪声性听力损失患病率明显升高, 由34.8%上升到70.O%,累积噪声暴露量与噪声性听力损失间存在剂量一反应关系

  噪声性听力损失易感?睦与GSTMl、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  对累积噪声暴露量、年龄与噪声性听力损失进行了Logistic回归分析,结果

  表明:累积噪声暴露量与噪声性听力损失的优势比为1.087,P值<O.05,表明累

  积噪声暴露量与噪声性听力损失间存在剂量一反应关系;年龄与噪声性听力损失 的优势比为1.041,P值<O.05,表明年龄也是影响噪声性听力损失的危险因素之

  对123例病例和123例对照进行了GSTMl基因分型,结果表明:病例组和

  对照组GSTMl基因缺失率分别为69.1%和56.1%,差异具有统计学意义(#=4.45,

  P<O.05),携带GSTMl(一)基因型发生噪声性听力损失的危险性是携带GSTMl

  (+)基因型者的l_75倍。对118例病例和114例对照对照进行了GSTTI基因

  分型,结果表明:病例组和对照组GSTTl基因缺失率分别为50.8%和57.9%,差

  异不具有统计学意义(z2=1.16,P>O.05)。GSTMl和GSTTl联合基因型分析表 明:在增强噪声性听力损失易感性方面,GSTMl和GSTTl基因型之间可能不存 在联合作用。

  MtDNA4977缺失与噪声性听力损失易感性 对117例病例干D122例对照进行了mtDNA4977缺失情况检测,结果表明:病例

  组和对照组的m∞NA4977缺失率分别为95.7%和95.9%,差异无统计学意义

  CDH23基因与噪声性听力损失易感性 对127例病例和127例对照进行了CDH23基因多念性检测,结果表明:

  CDH23.rsl227049位点在病例组CC、CG和GG基因型频率分别为39.6%、14.6% 和45.8%,等位基因C和G的频率分别为46.9%平11 53.1%;对照组三种基因型的 频率分别为50.9%、20.O%和29.1%,等位基因C和G的频率分别为60.9%和39.1%。 CDH23.rsl227051位点在病例组TT、CT和CC基因型频率分别为82.3%、17.7%

  和0,等位基因T和c的频率分别为91.2%和8.8%。;对照组三种基因型的频率

  噪声?睦听力损失易感性与GSTMI、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  分别为74.3%、25.7%和0,等位基因T和C的频率分别为87.1%和12.9%。 CDH23一rsl227049和CDH23一rsl22705l位点的基因型分布及其等位基因频率在 病例组和对照组之间差异均无统计学意义(P值>0.05)。多因素Logistic回归分

  析方法对个体间年龄、工龄、噪声暴露强度和累积噪声暴露量等因素进行校正后,

  未发现CDH23.rsl227049和CDH23一rsl227051两单核苷酸位点任一基因型噪声 性听力损失的危险性有显著性提高(P值>O.05)。

  感因素之一;而GSTTl基因缺失可能不是发生噪声性听力损失的易感因素之一: 在增强噪声性听力损失易感性方面,GsTMl和GSTTl基因之间可能不存在联合 作用。

  还不能认为职业性噪声暴露人群中mtDNA4977缺失与噪声性听力损失易感

  也不能认为职业性噪声暴露人群中CDH23基因CDH23-rsl227049和

  CDH23一rsl227051两单核苷酸多态性位点与噪声性听力损失易感性相关。

  听力损失,噪声性;易感性;基因多态;谷胱甘肽硫转移酶;DNA,线粒 体;基因缺失;钙黏素;剂量一反应关系

  噪声性听力损失昂感性与GSTMI、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态?出研究

  mitochondrial DNA、CDH23 genetic polymorphisms and susceptibility

  Postgraduate:Yang Zhenyu Supervisor: Associate professor Liu Yimin and Environmental Health Sciences

  Faculty ofprevention,School ofpublic health,Sun Yat-sen University

  Noise—induced heating loss(NIHL)is positive correlation to noise exposure

  from the aspect of strength and duration. individuals under

  However,dramatic diversity existed、^,itlliIl hearing loss among

  identical noise exposure;or the susceptible individuals required less noise exposure rmher than the non-susceptible individuals

  evidence above demonstrated that the difference in individual susceptibility to NIHL is

  factor inducing NIHL is noise exposure.However,many internal impact the severity of NIHL,which

  phenotypic susceptibility.Certain inhalational chemistry toxicants like toluene and carbon monoxide would deteriorate NIHL,cooperating with the noise.Other oto— toxicants like cisplatin

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTT!、MIDNA和CDH23基因多态性研究

  factors like low magnesium,low ferrum and hyperlipemia,would the individual susceptibility to NIHL.Genetic factor would impact it

  the genetic informmion carrieL Genes associated with the NIHL susceptibility such

  GSTMl、GSTTl、MtDNA、CDH23、Pmca2、Sodl、GPxl、AhI、HSPs

  discovered in recent years.along wi廿1 the application of molecular biological technics in NIHL research. Research

  the relationship between NIHL and NIHL susceptible genes is

  valuable in NIHL prevention.If the susceptible genes were identified,the susceptible individuals could be the

  of NIHL effectively to achieve the primary prevention goal.In this

  study,genes associated with NIHL to confirm the relationship,provide feasible genetic markers susceptible genes. for NIHL

  case—control study Was conducted among

  polymorphisms were detected with the method of multiplex polymerase chain

  Volunteers were recruited from three factory sites where noise exposure between 75dB were

  were used to obtmn related data about the

  噪声性听力损失易感性与GSTMl、GSTTI,MtDNA和CDH23基因多态性研究

  Extraction of DNA The DNA was extracted

  the indication of gene extraction kit.

  polymorphisms For GSTMl、GSTTI、mitochondrial DNA and CDH23,gene—specific primers for polymerase chain reaction were designed respectively using Primer Premier 5.0

  software.Co—amplifying GSTMl and Albumin gene to detect the absence of the GSTMl

  GSTTI gene.MtDNA49”deletion was detected with the method of nest PCR.As to the CDH23

  chain reaction—restriction fragment length means that their

  amplification products were digested埘th different and specific restriction enzymes

  NIHL wjth SPSS 1 1.0 software.The dose-response relmion GSTs and mtDNA4977 deletion

  genetic polymorphisms in different characteristic population were compared with chi—square test.And Logistic regression

  was used to decide the correlation difference was

  1.The general information about subjects

  254 noise—exposed individuals came from 3 different factories.127 were heating loss

  of age was 19.O~56.0 years old.and the

  range of years of noise exposure was 1~37 years

  噪声性听力损失易感性与GSTMl、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  old,and the mean year was 1 1.0士7.6 years old,The range of noise exposure was

  75.0~102.0dB and the mean was 90.7土8.4dB.The range ofCNE Was 52-3~96.1dB

  An increase of the rate of noise—induced hearing loss from 34.8%to 70.0%was found with the cumulative noise exposure was increased from 75dB to 1 05dB.It suggested that there was exposure

  logistic regression between years、cumulative noise exposure

  A logistic regression model was used to observe the relationship between years、 cumulative noise exposure and noise—induced hearing loss.It was demonstrated that the odds ratio for noise—induced hearing loss was 1.087 which showed statistical

  development of noise—induced hearing loss.

  cases and controls,and their difference was statistically significant(一-4.45, P<0.05).Persons with GSTMl(一)had higher risk ofnoise—induced hearing loss than

  their difference was not statistically

  gene had no combined action.those who with

  higher risk of developing noise—induced hearing loss

  with GSTMl(+)GSTTI(+)(Z2=O.16,P>O.05).

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTT!、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  The frequency of mtDNA4977 deldion were 95.7%and 95.9%.respectively,in

  and controls,their difference was not statistically

  6.CDH23 gene Frequency of genotypes CC、CG and GG in the rsl227049 locus were 39.6%、

  respectively,in the control group,and frequencies of alleles C locus were 46.9%and

  39.1%.respectively,in the control group.Frequency of genotypes TT、CT and CC in

  the rsl 22705 1 locus were 82.3%、1 7.7%and 0,respectively,in the

  74.3%、25.7%and 0,respectively,in the control group,and frequencies ofalleles T

  91-2%and 8.8%,respectively,in the case group

  for age、year ofexposure noise and cumulative noise exposure

  with multivariate logistic regression

  dose?response relationship between cumulative noise

  exposure and noise—induced hearing loss.

  of risk factors contributing to development of noise—induced heating loss,but GSTTl gene deletion may not be

  noise-induced heating loss.For the susceptibility to noise—induced hearing loss,the

  GSTMl and GSTTI gene had no combined action.

  噪声性听力损失易感?;:生与GSTMI、GSTTl、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  susceptible to noise—induced hearing loss.

  4.It was suggested that in the occupational noise—exposed individuals

  polymorphisms ofthe rsl227049 and rsl227051 loci in the CDH23 gene might not be

  susceptible factor for noise-induced hearing loss.

  Hearing loss,noise?induced;Susceptibility;Polymorphism:Glutathione S-transeferase:DNA,mitochondrial;Gene deletion;Cadherin23:dose.response relation

  噪声性听力损失易感?|生与GSTMl、GSTTl、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  生产劳动环境中,噪声普遍存在,接触机会很多。噪声是一种频率与强度变 化毫无规律随机组合的声音,对人体造成的危害是多种多样的,尤其是工业生产 中产生的职业性噪声对劳动者产生的危害。噪声性听力损失(noise—induced

  loss,NIHL)已成为最主要的职业危害之一。全世界约有6亿人口在有害

  的噪声环境下作业,美国约有0.1亿人口的永久不可逆性听力损失是由噪声和外 伤引起的“1,44%的木工和48%的水管工人有感觉性听力损失,90%的煤炭工人到 52岁出现听力损害。NIHL也是军人中最常见的职业性疾患,美国政府每年花费 2.5亿多美元来防治军事中导致的NIHL。尽管采取的一些听力保护措施是有效 的,然而,接噪工人先天的局限使很大一部分永久性听力损失在相对短的噪声暴 露后发生。 人们在长期的实践中已经发现个体对噪声暴露的易感性有明显差异,表现为 等量的噪声暴露导致不同的永久性听阈位移(permanent

  有研究发现累积噪声暴露量相同的噪声暴露工人平均听力损失最多相差可达 40dB,动物实验研究也显示同种动物暴露于相同噪声后听闻位移不等的现象,可 见NIHL个体易感性差异具有一定的生物学普遍性。 造成N1HL的主要因素是噪声暴露量,然而有相当多的体内外因素可以影响 NIHL的易感性。一般认为NIHL易感性与遗传有关,但决定听觉系统对噪声危 害敏感性个体差异的物质基础是什么,从现有的知识和经验推测可能与某些效应 分子,如某些酶、受体、内源性激动或拮抗剂等的功能和结构在个体问存在差异 有关,而所有蛋白类效应分子的结构都由体内的基因序列决定。因此,在DNA水 平探讨导致NIHL个体敏感性差异的物质基础具有重要意义。 谷胱甘肽硫转移酶MI(Glutathione 硫转移酶T1(Glutathione 酶(Glutathione

  S-transeferase,GSTs)同功酶中的GST-g和GST-0酶,GSTMl

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  和GSTTI的多态性被认为与个体疾病易感性有较大的相关性,是当前GSTs酶 家族研究焦点所在。有证据表明噪声可通过活性氧(reactive

  引起的细胞损伤损伤内耳组织。GSTs催化谷胱甘肽的结合和运输,并且认为在 抗氧化的细胞中起关键作用。由于他们在抗氧化中的关键作用,推测GSTs可能 在耳蜗的抗氧化应激中起保护作用。由于GSTMl或(和)GSTTl缺失的个体不 能代谢对于这些酶特异的毒物,推测携带这些基因缺失型的个体可能提高对于噪 声和氧自由基造成损伤的易感性。Peter M等。1研究发现GSTMl基因型在噪声暴 露个体中明显的保护作用,未发现GSTTl的保护作用。国内有研究发现携带

  GSTTl缺失基因型个体对NIHL危险度显著提高,未发现GSTMl缺失基因型与

  NIHL危险度的相关性。1。 噪声可引起组织内多种血管收缩,导致内耳微循环改变,不同程度地引起内

  耳听器的缺血和缺氧,导致Corti器和毛细胞功能障碍“1。而缺血和缺氧可引起

  氧自由基的升高,自由基会对细胞和亚细胞结构造成损害。线粒体的主要功能是 通过氧化磷酸化合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP),是细胞内能量 产生和氧代谢的场所,也是自由基产生的场所。正常情况下,自由基不断地产生, 同时也被不断地清除,使自由基浓度维持在对机体产生危害的限度以下。有研究 表明在受到噪声刺激时,耳蜗、蜗核的血流减少,引起内耳缺血和缺氧,使抗氧 化能力降低,自由基的清除能力下降,引起内耳自由基升高”1。同时线粒体的缺 失引起线粒体氧化磷酸化能力的降低,导致ATP产量的减少以及活性氧等自由 基产量和毒性的增加。在噪声和线粒体缺失的共同作用下,体内活性氧等自由基 累积,进一步加强氧化损伤作用,形成恶性循环,加重线粒体缺失。当线粒体缺 失累积到一定程度,氧化磷酸化产生的能量低于维持正常细胞的功能阈值时,组

  织器官开始退化,有可能出现临床症状。赵等”|研究发现暴露噪声组与非暴露噪 声组线kb缺失发生频率有明显的差异,初步证实了线kb缺失与NIHL相关的假说。Ueda,N”3检测了60个感觉神经性听力损 失(sensorineuralhearing loss,SNHL)病例和47个正常对照的mtDNA497 7缺失 情况,与对照组相比,SNHL病例组有明显的mtDNA4977缺失率,并且mtDNA4977 缺失率随听力损伤严重程度的升高而升高,说明mtDNA4977缺失与SNHL的高度 相关。韩维举。1研究发现,长期白噪声暴露后发生永久性阂移的大鼠耳蜗、蜗核

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTI,MtDNA和CDH23基因多态性研究

  和颞叶脑组织可发生mtDNA4834缺失,其发生率明显高于对照组;而噪声暴露组 中与听觉无关的颞肌组织mtDNA“4缺失发生很低,与对照组相比差异无显著性。 提示mtDNA4s34缺失与噪声性听力损失有关。鼠mtDNA4834bp缺失与人 mtDNA4977bD缺失类似,而关于人mtDNA4977缺失与噪声性听力损失关系的人 群研究国内外均未见报道。 钙黏素是重要的黏附分子,是膜表面糖蛋白类受体,参与细胞与细胞的黏附。 高强度噪声暴露可损伤内耳感觉毛细胞硬纤毛,而硬纤毛在把声音从机械刺激转 换为电化学信号过程中起作用,这一病理变化与噪声引起的听力损失有关。因为 钙黏素23对于硬纤毛的组织比较重要,而这些结构又会受到噪声的损伤,推测 带有这些基因突变的个体可能对噪声性听力损失易感。而且已有研究证实携带 Cdh23缺失突变基因的杂合型鼠易发生NIHL。RalphH等。3研究发现Cdh23缺失 突变纯合型鼠发生耳聋而且静纤毛束紊乱,杂合型鼠在5~6周呈低频和高频听 力损失,而且Cdh23缺失突变杂合型引起的PTS是野生型的两倍。这些都依赖 是否携带Cdh23基因突变这一遗传背景,说明Cdh23基因与NIHL易感性相关。 但是关于CDH23与噪声性听力损失的人群研究却很少见报道。 以上各动物和人群研究都取得了一定的成效,但对于这些基因的多态性与 NIHL易感性关系却没有统一的定论。为进一步探讨这些基因与NIHL易感性的 关系,确认NIHL易感基因,我们运用病例一对照研究方法和PCR(polymerase

  reaction,PCR)技术对GSTMl、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性

  与NIHL易感性关系进行了人群调查和研究,为这些易感基因的确认提供初步的 理论依据。 本课题的研究目标是:通过病例一对照研究方法和PCR技术,了解NIHL易 感性与GSTMI、GSTTI、mtDNA和CDH23基因多态性的关系。研究内容包括: 噪声暴露量与N1HL的量效关系; GSTMI和GSTTI基因多态性与NIHL易感 CDH23基因多态性与

  性的关系;mtDNA基因多态性与N1HL易感性的关系; NIHL易感性的关系。

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  (1)电子分析天平 (2)IKA蜗旋混匀器 (3)恒温水浴箱 (4)制冰机 (5)大容量冷冻离心机(MAX 145000rpm) (6)小容量冷冻离心机(MAX 130000rpm) (7)微波炉 (8)蛋白核酸分析仪 (9)凝胶成像及分析系统

  (12)电泳槽(POWER/PAC200) (13)4℃低温冰箱 (14)一20℃冰箱 (15)一80℃低温冰箱 (16)可调式微量加样器

  堡垒丝堕生塑叁墨查:坠墨鱼!!塑!:垒!!!!:塑!望!垒塑£旦旦塑叁璺量查坚盟壅———————墨三主一

  (5)BshNl内切酶 (6)HaelII内切酶 (7)琼脂糖 (8)溴乙啶 (9)二甲基苯氰、溴酚蓝、甘油 (10)引物

  (EDTA.Na2H20),在磁力搅拌器上剧烈搅拌,用NaOH调节溶液的PH值到8.0, 然后定容至1 L,分装后高压灭菌备用。

  噪声性听力损失易感挂与GSTMl、GSTT],MtDNA和CDH23基因多态性研究

  50×TAE(Tris一乙酸)储存液:2429Tris碱、57.1ml冰乙酸、100m10.5moFL

  l×TAE使用液:20ml 50×TAE储存液加水稀释至1000ml。 10mg/ml溴化乙锭:100m]水中加入lg溴化乙锭,磁力搅拌数小时以确保 其完全溶解,然后转移至棕色瓶中,室温保存。 磷酸盐缓冲液(PBS):800ml蒸馏水中溶解89NaCl、0.29kcl、1.449Na2HP04 和0.249KH2P04,用HCl调节溶液的PH至7.4,加水定容至1L,高压下蒸气 灭菌20分钟,室温保存。 70%乙醇:70ml乙醇加水30ml混匀。 10×上样缓冲液:称取0.259溴酚蓝、0.259二甲基苯氰,吸取30ml甘油, 加去离子水定容至100ml。

  选择某造纸厂、啤酒厂和汽车厂等几个企业连续性噪声暴露强度在75-- 105dB的不同车间,工作中不接触高温、毒物的工种,工龄一年以上,未使用个 体防护用品(耳塞或耳罩),接噪前未患听觉系统疾病,无头部外伤史,体检前 一月无发热的工人作为研究对象。

  参考我国《职业性听力损失诊断标准》(GBZ49—2002),根据明确的职业噪 声接触史,自觉的听力损失或耳鸣的症状,纯音测听为感音性聋,结合动态观察

  噪声.眭听力损失易感性与GSTMi,GSTTi、MtDNA垄垦墅旦塑叁旦兰查坚壁塞

  照人的气导听闽与年龄和性别的关系》(GB7582)中耳科对照人(18~70岁)

  根据课题要求设计《职业性噪声暴露对象个体情况调查表》,逐个对病例组 和对照组的研究对象进行调查,内容包括一般情况、职业史、个体防护情况、爆 震史、家族史、既往史、自觉症状、毒物接触史、高血压病史、个人生活习惯和 居住环境等。

  暴露时间。根据等能量原理及赵氏公式将SPL、每天暴露时间和噪声作业工龄合 并为累积噪声暴露量(cumulative

  CNE=10×log[∑10“…”“×噪声作业工龄j×每天噪声暴露时间,÷480] i为职业史中的噪声作业工种及其对应的噪声暴露条件。

  采用空腹静脉抽血的方法,对所选的研究对象每例抽取2ml外周血放入2ml 的EDTA.Na2抗凝管中,立即颠倒混匀,放入冰盒内携带运输送回实验室。采集

  样品于当天500pl抽提基因组DNA;剩余样品转移至一80℃冰箱内冻存。

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTl,MtDNA和CDH2.I基因多态性研究

  采用基因组抽提试剂盒抽提外周血基因组DNA,步骤如下: (1)外周抗凝血500pl加入到500plPBS中,12,000rpm离心5分钟,弃上清。 (2)加入TLE溶液I 500pl后立即振荡混匀,室温放置10分钟以上(此时几 乎看不到DNA沉淀)。然后室温条件下12,000rpm以上离心5分钟。 (3)用枪头小心去除上清(倒置离心管,轻倒即可),加入imlTLE溶液II。 (4)上下颠倒离心管数次,室温12,000rpm阱上离心2分钟。 (5)用枪头小心去除上清(倒置离心管,轻倒即可)。 清除,否则将影响DNA纯度。) (6)向离心管中加入TLE溶液IIl500肚l,上下颠倒充分混匀。 (7)室温12,000rpm以上离心5分钟。 (8)把上清转移至另一个新准备的离心管中。 (9)加入等体积(500p_1)的异丙醇到上清液中,上下颠倒离心管数次,此时可 以看到DNA沉淀。 (10)4℃、12,000rpm离心5分钟,d,,6N掉上清。(注意:一定要小心,以 防DNA沉淀丢失。) (11)用70%乙醇lml清洗沉淀,4℃、12,000rpm离心5分钟,然后小心倒掉 上清,打开离心管盖子放入4℃冰箱中。 (12)根据下一步实验需要,加入TE 509l,4"C、12,000rpm离心1分钟, 一20℃长期保存。 (注意:上清必须彻底

  19lDNA模板溶液加入到999l的去离子水中,充分混合,以去离子水为空

  白对照,用紫外分光光度仪分别测定波长260rim和280rim时的OD值,计算 OD260/OD280值,如果OD260/OD280值在1.8~2.0之间,此DNA纯度合格,可作

  噪声性听力损失易感性与GSTMi、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  利用引物设计软件Primerpremier5.0并参考文献分别设计GSTMl、GSTTl、

  mtDNA和CDH23基因相应的引物,再用Oli906.0对该引物进行评价,得出关 于各引物的GC含量、11m值、发夹结构和引物二聚体等性质参数。上海Sangon

  公司进行引物合成,然后各引物加入去离子水溶解成浓度为10I_tM/L,一20。C保存

  备用。引物序列及扩增片段长度如表2-1,各基因PCR反应体系和条件如表2—2 和2—3。

  墨生竺堕生塑叁墨垒竺墨生苎!墅!:鱼墨!!!:塑!坠堕垒垄CDH23基因多态性研究

  噪声性听力损失易感性与GSTMl、GSTT]、MIDNA和CDH23基因多态性研究

  双重PCR方法扩增GSTMI和Albumin基因。“,以Albumin为内对照,PCR

  产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,电泳条件80V电压,45分钟。电泳后2%琼脂糖凝 胶在凝胶成像及分析系统下进行结果观察:若有350bp的目的条带,则表明此样

  品扩增成功;同时存在219bp和350bp的目的条带,则该样品为GSTMl基因非 缺失型GSTMl(+);只有350bp的目的条带,则该样品为GSTMI基因缺失型 GSTMl(一)。对于未扩增出350bp内对照目的条带的样品,需重新PCR反应 进行基因分型。

  双重PCR方法扩增GSTTl和Albumin基因9“,以Albumin为内对照,PCR

  产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,电泳条件80V电压,45分钟。电泳后2%琼脂糖凝

  胶在凝胶成像及分析系统下进行结果观察:若有350bp的目的条带,则表明此样

  品扩增成功;同时存在460bp和350bp的目的条带,则该样品为GSTTl基因非 缺失型GSTTl(+);只有350bp的目的条带,则该样品为GSTTl基因缺失型 GSTTl(一)。对于未扩增出350bp内对照目的条带的样品,需重新PCR反应进 行基因分型。

  检测mtDNA4977缺失的引物位置如图2一l所示。引物对P7(nt3153—3172)、 P8(m355卜3531)可以扩增编码正常MtDNAtRNA和NDl片段的NADH基因, 长度为398bp。凡是未扩增到代表正常mtDNA的398bp产物的DNA模板,不 用于下一步mtDNA4977缺失的检测。引物对P9(8251—8270)、P10(13845—13826)

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTi、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  及P11(8292—8312)、P12(13584—13564)组合起来,用于巢式PCR检测mtDNA4977 缺失的存在。对于正常的mtDNA,因较短的延伸时间不足以合成大于5kb的片 断,此巢式PCR将无阳性产物;若mtDNA4977缺失存在,P9、P10可扩增到618bp 的片断,P11、P12位于P9、P10的内侧,可扩增到315bp的目的条带。如果以

  P9、P10的扩增产物为模板,以P11、P12为引物再行PCR扩增,即巢式PCR,

  引物对P11、P12的PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像及分 析系统下进行结果观察:若有315bp的目的条带,则该样品为mtDNA4977缺失基 因型,若无则该样品为mtDNA4977非缺失基因型。另取109l PCR扩增产物送 TaKaRa公司,经纯化、连接、转化、克隆后进行测序。

  reaction—restriction fragment length

  采用PCR.RFLP方法检测CDH23基因单核苷酸多态性位点rsl227049的多

  态性。首先PCR扩增CDH23基因,所得PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,电 泳条件80V电压,45分钟。凝胶成像及分析系统下进行结果观察:若有593bp

  墨兰丝生垄塑塑查丝量鱼!!塑!:璺!!!!:塑!望墨垒查£旦旦望墨旦至查坚堡窭

  的目的条带,提示PCR扩增成功,可进行下一步的限制性酶切反应。所用限制 性内切酶为BanI,15pl反应体系包括:10山PCR产物,lgl(10U)BanI内切

  酶,2u110×Buffer O,21al 10×Buffer Tango…,酶切条件为37。C恒温水浴16小

  时。酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像及分析系统F进行结果观察: 若仅有593bp目的条带,则该样品为GG基因型(野生型);若有593bp、367bp 和226bD目的条带,则该样品为GC基因型(杂合型);若有367bp和226bp目

  采用PCR-RFLP方法检测CDH23基因单核苷酸多态性位点rs]227051的多

  态性。首先PCR扩增CDH23基因,所得PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,电 泳条件80V电压,45分钟。凝胶成像及分析系统下进行结果观察:若有202bp 的目的条带,提示PCR扩增成功,可进行下步的限制性酶切反应。所用的限 制性内切酶为Haelll,l 5山反应体系包括:109lPCR产物,lul(10U)HaeⅢ内

  切酶,2/.t]10×BufferR+,2¨l 10×BufferTango…,酶切条件为37℃恒温水浴16

  小时。酶切产物进行3%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像及分析系统下进行结果观察:

  若仅有202bp目的条带,则该样品为TT基因型(纯合型);若有202bp、167bp 和35bp目的条带,则该样品为TC基因型(杂合型);若有167bp和35bp目的 条带,则该样品为CC基因型(野生型)。

  应用SPSSll.0软件包进行统计分析,检验显著水甲为0.05。噪声累积暴露

  量与NIHL的量效关系,基因型频率的组间比较用f检验;Logistic回归分析噪

  声累积暴露量与NIHL的关系;多因素Logistic回归分析方法对个体间年龄和累 积噪声暴露量等因素进行校正。

  墨差些堑查塑叁墨垒?些墨鱼墨!塑!,垒苎!TI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  75~105dB的不同车间,工作中不接触高温、毒物的工种,工龄一年以上,未使 用个体防护用品(耳塞或耳罩),接噪前未患听觉系统疾病,无头部外伤史,体 检前一月无发热的工人为对象进行调查。共筛查出符合条件的对象254例,其中 病例和对照各127例,病例组和对照组的基本情况如表3—1。统计分析表明,病 例组与对照组年龄、接噪工龄、噪声暴露强度和累积噪声暴露量差异、不具有统 计学意义。

  双重PCR方法扩增GSTMl和Albumin基因,以Albumin为内对照,PER

  产物进行2%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像及分析系统下进行结果观察。如图3—1

  所示:同时存在219bp和350bp目的条带的样品为GSTMl(+)基因型;只有 350bp的目的条带的样品为GSTMl(一)基因型。

  噪声性听力损失易感?|生与GSTMl、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  l、3、5、6泳道为GSTMI(+)基因型 2、4泳道为GSTMl(一)基因型.

  双重PCR方法扩增GSTTl和Albumin基因,以Albumin为内对照,PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳后凝胶成像及分析系统下进行结果观察。如图3

  所示:同时存在460bp和350bp目的条带的样品为GSTTl(+)基因型;只有 350bp目的条带的样品为GSTTl(一)基因型。

  l、2、3泳道为GSTTl(+)基因型 4、5泳道为GSTTI(一)基因型

  巢式PCR方法检测mtDNA4977缺失。如图3-3所示,引物对P7、P8扩增编 码正常mtDNAtRNA和NDl片段的NADH基因,长度为398bp,凡是未扩增到

  噪声性听力损失易感性与GSTM!、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  代表正常mtDNA的398bp产物的DNA模板,不用于下一步mtDNA4977缺失的 检测。引物对P9、P10及P11、P12组合起来,用于巢式PCR检测mtDNA4977 缺失的存在。以P9、P10的扩增产物为模板,以P11、P12为引物再行PCR扩增, 即巢式PCR,可扩增到检测mtDNA4977缺失的315bp目的条带,如图3-/1所示。

  引物对P7、P8扩增编码正常mtDNAtRNA和 NDI片段的NADH基1因398bp目的条带电泳结果 M泳道为100bp DNA Ladder; 卜5泳道为NADH基因阳性.

  引物对P11、P12扩增反映mtDNA4977缺失的 315bp日的条带电泳结果 M泳道为100bp DNA Ladder; 卜5泳道为mtDNA4977缺失基因型.

  PCR—RFLP方法检测CDH23基因rsl227049位点的多态性。首先PCR扩增 CDH23基因,所得产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像及分析系统下结果观

  察:若有593bp的目的条带,提示PCR扩增成功,可进行下一步的限制性酶切

  反应。酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像及分析系统下结果观察:若 仅有593bp目的条带,则该样品为GG基因型(野生型);若有593bp、367bp和 226bp目的条带,则该样品为GC基因型(杂合型);若有367bp和226bp目的条

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  CDH23.rsl227049位点基因电泳结果 M泳道为100bp DNA Ladder: l、5泳道为CC基冈型; 2、4泳道为GC基因型; 3、6、7泳道为GG基因型.

  PCR-RFLP方法检测CDH23基因rsl227051位点的多态性。首先PCR扩增

  CDH23基因,所得产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像及分析系统下结果观

  察:若有202bp的目的条带,提示PCR扩增成功,可进行下一步的限制性酶切 反应。酶切产物进行3%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像及分析系统下结果观察:若 仅有202bp目的条带,则该样品为TT基因型(纯合型);若有202bp、167bp和 35bp目的条带,则该样品为TC基因型(杂合型);若有167bp和35bp目的条带, 则该样品为CC基因型(野生型)。

  噪声性听力损失易感性与GSTMI.GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  图3.7检测mtDNA4977缺失PCR扩增产物测序结果 其中方块中为13bp的重复序列,箭头8470和8482分别 指该序列首末端在线粒体上对应的碱基位置

  噪声性听力损失易感性与GSTMl,GSTT!.MIDNA和CDH23基因多态性研究

  如图3—7所示,测序结果证实,扩增的315bp目的条带的碱基序列与理论上以 P11、P12为引物所扩增片段的碱基序列完全吻合,反映PCR过程中无错误碱基掺 入以及测序过程中无错误读码。结合测序结果及发表的mtDNA的全序列进行分

  析,发现nt8470~8482及ntl3447~13459为核苷酸序列完全相同的13bp重复区(该 区核苷酸序列为5’一ACCTCCCTCACCA一3’),缺失发生在这对13bp重复区之

  间,其中nt8470~8482序列被保留,而ntl3447~13459序列则随mtDNA4977缺失 一同丢失。

  性听力损失患病率进行分析。在254例噪声暴露工人中共发现127例听力损失患 者,听力损失患病率50.O%。分析时,按照累积噪声暴露量的大小对其进行分级, 并计算不同级别下的噪声性听力损失患病率,结果如表3—2。 由表3-2和图3—8可以看出,随着累积噪声暴露量的增加,噪声性听力损失 患病率明显升高,由34.8%上升到70.O%,累积噪声暴露量与噪声性听力损失间

  噪声?|生听力损失易感性与GSTMl、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  年龄与噪声性听力损失进行了Logistic回归分析。以累积噪声暴露量、年龄为自

  归分析,结果见表3—4。 结果表明:累积噪声暴露量与噪声性听力损失的优势比为1.087,P值<O.05, 表明累积噪声暴露量与噪声性听力损失之间存在剂量一反应关系,与单因素分析 结果‘致;年龄与听力损失的优势比为1.041,P值<O.05,表明年龄也是影响噪 声性听力损失的危险因素之一。 表3

  B:回归系数;S.E.:标准误;df:自由度;Sig.:P值;Exp(B):优势比;95.0%C.1

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  行GSTMl基因分型,其中最后确定病例123例,对照123例,基因分型结果见 表3-4。统计分析表明:病例组和对照组GSTMl基因缺失率分别为69.1%和

  56.1%,差异具有统计学意义(x2=4.45,P<O.05)。携带GSTMl(一)基因型发

  注:f=4.45,P<O.05;OR=I.75,95%CI(1.038~2

  行GSTTl基因分型,其中最后确定病例118例,对照114例,基因分型结果见 表3-5。统计分析表明:病例组和对照组GSTTI基因缺失率分别为50,8%和

  注:f=1.16,P>O.05;OR=0.75,95.0%CI(o.45~1.26)

  噪声性听力损失易感性与GSTMl、GSTTl、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  以GSTMI(+)GSTTl(+)为参照组,结果见表3—6。统计分析表明:携带

  GSTMl(+)和GSTTl(一)基因型者发生噪声性听力损失的危险性是携带

  GSTMl(+)GSTTl(+)的o.75倍(f=1.69,P>0.05),不具有统计学意义;

  携带GSTMl(一)和GSTTl(+)基因型者发生噪声性听力损失的危险性是携

  带GSTMI(+)GSTTI(+)的1.21倍(i:o.96,P>0.05),不具有统计学意

  义;携带GSTMl(一)和GSTTl(一)基因型者发生噪声性听力损失的危险性

  是携带GSTMl(+)GSTTI(+)的1.11倍(f=o.16,P>0.05),不具有统计

  学意义。可见在增强噪声性听力损失易感性方面,GSTMl和GSTTI和因型之间 可能不存在联合作用。

  对254例研究对象进行mtDNA4977基因分型,其中最后确定病例117例,对照

  122例,基因分型结果见表3—7。统计分析表明:病例组和对照组的mtDNA4977缺

  失率分别为95.7娇n95.9%,病例组发生噪声性听力损失的危险性是对照组的0.96

  噪声性听力损失易感性与GSTMJ、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  为研究CDH23基因多态性与噪声性听力损失易感性的关系,对254例研究 对象进行mtDNA4977基因分型,其中最后确定病例127例,对照127例,基因分 型结果见表3-9和3—10。统计分析表明:rsl227049位点在病例组CC、CG和 GG基因型频率分别为39.6%、14.6%和45.8%,等位基因C和G的频率分别为 46.9%和53.1%;对照组三种基因型的频率分别为50.9%、20.O%和29.1%,等位 基因c和G的频率分别为60.9%和39.1%。rsl227051位点在病例组TT、CT和 CC基因型频率分别为82.3%、17.7%和0,等位基因T和c的频率分别为91.2% 和8.8%。:对照组三种基因型的频率分别为74.3%、25.7%和0,等位基因T和c 的频率分别为87.1%和12.9%。两位点的基因型分布及其等位基因频率在病例组 和对照组之间差异不具有统计学意义(P值>0.05)。

  墨苎?些堕生塑叁墨垒:些墨璺!坠!!:曼!!!!:塑!里塑皇童£里望!!墨璺童查:些堡曼

  采用多因素Logistic回归分析方法对个体问年龄、工龄、噪声暴露强度和累 积噪声暴露量等因素进行校正后,计算调整后的OR值,结果见表3—10。统计 分析表明:校正后未发现CDH23.rsl227049和CDH23.rsl22705l两单核苷酸位 点任一基因型的噪声性听力损失的危险度有显著性提高(P值>O.05)a

  噪声性听力损失易感性与GSTM!、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位,细胞或生物体中一套完整单倍 体的遗传物质的总和称为基因组(genome)。人类基因组是一个结构十分稳定的 体系,然而人类基因组又是一个变异的体系,在长期进化的过程中,基因组的 DNA序列不断地发生变异,其中部分变异被代代保存了下来导致了人类基因组 的差异及多态性。通常多态性(polymorphism)是指一个基因座位上存在多个等位 基因(allele)。对某一个基因座位,一个个体最多只能有两个等位基因,分别来自 父母方的同源染色体上,这是个群体概念,指群体中不同个体在等位基因拥有多 态上存在差别。基因多态性研究方法“”有①聚合酶链式反应的方法及其相关技

  术;②巢式PCR(nestPCR);③多重PCR(multiplePCR):@PCR一单链构象多态

  称为点突变(poim mutation)。基因突变可分为碱基置换、移码突变和大段损伤

  ““。碱基置换(base substitution)指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变,

  如果是嘌呤置换另一嘌呤或者是嘧啶置换另一嘧啶,称为转换(transition),如 果是嘧啶换成嘌呤或者嘌呤换成嘧啶,称为颠换(transversion)。移码突变

  (frameshift mutation)指发生一对或几对的碱基减少或增加。大段损伤指DNA

  理想的突变检测方法应具有如下特征:可检片段长及上千个碱基、具有100% 的检测效率、无假阴性或假阳性结果、操作流程简单、无需复杂的仪器设施、不 涉及有毒害试剂、耗时少且花费低,但能够鉴别出固有突变并获得很好的一致性

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  结果。根据检测原理可将众多的基因点突变方法分为三大类“”①物理方法:利用 碱基突变引起的物理变化,最终导致电泳迁移漂变而被检测,有利于确定含突变 片段后的进一步测序;②裂解法:相差单个碱基的野生型与突变型异质杂合双链 中的错配碱基,使裂解法具有双重的突变检测机会;③其它方法包括毛细管电泳、

  变性高效液相色谱分析(Denaturing high-performance

  发展潜力的DNA芯片技术(DNA chips)及相对准确完美的测序法(Sequencing)。

  频率不小于1%。SNPs具有以下特点及优点“”:①数量多、分布广;②易于自动 化分析;③)遗传稳定性强;④多态性丰富,是最常见的遗传变异类型。

  本研究检测了GSTMl、GSTTl、MtDMA和CDH23基因的多态性位点,根据 不同基因位点的多态性选择不同的检测方法。GSTMl和GSTTl基因突变属于大

  片段的缺失,均分为基因缺失型和非缺失型,因此,均采用快速可行的双重PCR

  法,以Albumin为内对照扩增目的片断,再根据片断大小,进行不同浓度的琼脂 糖凝胶电泳鉴定基因型。对于mtDNA4977的缺失用巢式PCR方法检测其存在,与 单纯PCR方法相比,巢式PCR灵敏度大大提高,可以检出及微量的mtDNA4”7缺 失。CDH23.rsl227049和CDH23-rsl227051两位点属于已知突变点的人群多态性 检测,这两个位点均为限制性酶切位点,所以选择聚合酶链式反应一限制性片断

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTl,MtDNA和CDH23基因多态性研究

  平,而且还取决于噪声水平、类型及接触时间的长短。在过去研究中,人们已经 利用类似暴露和累积效应的原理进行分析和评价。为了将噪声累积暴露的概念变

  为实际可操作的数学模型,有人提出等能量学说的理论,该学说认为假使噪声暴 露的能量相同,生物效应也相同,因此,用物理学原理可以推倒出相应的累积噪 声暴露量“…。早已证实长期接触中高剂量噪声可以引起听力损失,且累积噪声暴 露量与高频听力损伤患病率之间存在剂量一反应关系,对接触中低剂量噪声的工 人进行了观察,同样证实了中低剂量噪声暴露与高频听力损伤之间存在剂量一反 应关系,长期接触中低剂量噪声可在一定程度上引起高频听力损伤。采用剂量患 病率寿命表法对接噪作业工人噪声性耳聋的发病情况作相关回归分析,结果接噪 工人噪声聋患病率随累积接噪量的增加而升高。 本研究以累积噪声暴露量作为评价工人接触噪声的量化指标,以噪声性听力 损失患病率作为听损指标,研究噪声暴露量与噪声性听力损失的关系。统计分析 结果显示:随着累积噪声暴露量的增加,噪声性听力损失患病率明显升高,呈典 型的剂量一反应关系,与以往研究结果一致。

  GSTs是一个超基因家族,至少有16个基因编码表达于组织细胞液的GST; 至少有6个基因编码表达于膜的GST““。在人类,根据酶的底物特性、化学亲 和力、结构、氨基酸序列及动力学行为等因素,GSTs可分为八种,即 alpa(A),mu(M),theta(T),pi(P),zeta(Z),sigma(S),kappa(K),chi和omega(O)”…。 到目前为止,GSTAl、GSTA2、GSTMl、GSTM3、GSTTl、GSTT2、GSTPl、

  GSTZl、GSTO已证实在人群中具有多态性,其中GSTMl、GslM3、GSTTl、

  GSTPl的多态性被认为与个体疾病易感性有较大的相关性,是当前GSTs酶家

  噪声性听力损失易感性与GSTMI、GSTTl、MIDNA和CDH23基因多态性研究

  族研究焦点所在。GSTMl和GSTTl分别编码GST同功酶中的GST-la和GST-0 酶。GSTM有5个亚家族(GSTMl—5),约长20Kb,均定位于人染色体lpl3.3, 依次为5’一GSTM4一GSTM2一GSTMl一GSTM5一GSTM3—3’。GSTM已证实在 人群中有三个等位基因,即GSTMI*0、GSTMI*A和GSTMI*B。GSTMl}O属

  于纯合子基因缺失型,不能编码有相应活性的酶蛋白;GSTMl*A和GSTMl+B 之间的区别仅在于外显予7处有一个碱基不同,因而分别编码具有活性的同二

  聚体、异二聚体,酶的催化活性相似““…。GSTT基因有两个亚家族,即GSTTI 和GSTT2,均定位于人染色体22q11.2上,GSTTl和GSTT2之间大约相隔50kb, 基因结构相似,均由5个外显子和相似的外显子\内显子分界线。GSTTl

  纯合子缺失为GSTT—null基因型,为整个基因的缺失或部分缺失,导致GSTTl

  酶活性缺失。至少有一个基因拷贝则为GSTTl阳性基因型。24…。 人类GST基因有遗传变异。将近50%的高加索人有GSTMl缺失,25—40%的人 口是GSTTl缺失基因型。然而,GSTMl与GSTTl基因型并无相关,GSTMl缺失 个体并非GSTTl缺失,反之亦然。

  越来越多的证据表明噪声可通过ROS介导的细胞损伤损伤内耳组织”“”1。在

  过去几年里,已累积了许多ROS与噪声引起的耳蜗损伤的联系的证据:尽管一定 强度的噪声消耗耳蜗很多能量以致导致明显的机械性损伤“7’2…;高强度的噪声暴 露从代谢学上影响耳蜗。”“;过多声音的暴露导致耳蜗活性氧族和其他自由基分

  子的产生“2。3“,当耳蜗有活性氧族和其他自由基分子产生,这些活性氧族就很可

  能导致耳蜗和听力损失。…。耳蜗不同组织对ROS的损伤作用反应不同,这是由内

  在的抗氧化水平决定的”“。例如:在动物研究中已发现抗氧化作用的VitC和ViLE

  对于噪声引起的耳蜗损伤有保护作用。“;在低蛋白饮食中给予鼠VitC和GSH降低 对耳毒性的易感性㈨;噪声暴露前给予豚NVitC降低毛细胞损失。…;通过饮食供 给包括VitC和VitE在内的抗氧化物质降低鼠由于年老造成的听力损失。“。 Richard“”通过三种不同的实验方法成功地证明了通过增加内在的耳蜗氧化应激 防御能力可避免过多声学暴露导致的损害。在成年内耳内已识别到几个解毒和抗 氧化酶,包括:过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和GST”“4“。 GSH及GSH相关的酶,在细胞毒素、致癌物和ROS的代谢和解毒过程中起作

  噪声性听力损失易感性与GSTMl、GSTTI、MIDNA和CDH23基目多态性研究

  中一个关键的抗氧化成份。充分的证据表明耳蜗内的谷胱甘肽在保护耳蜗避免毒 物和噪声导致的氧化应激中起重要的作用“…,并且进行了实验研究以进一步强 化:供应抗氧化剂,尤其是可提高谷胱甘肽水平的抗氧化剂可减少噪声性听力损 失;动物噪声暴露后耳蜗谷胱甘肽水平提高;GSH缺乏与噪声引起的损伤易感性 提高相关,而补充谷胱甘肽则可降低易感性““。GST催化GSH的结合和运输,并 且认为在抗氧化的细胞中起关键作用。不同的GST对于不同的底物有不同的亲合

  GST可能在耳蜗抗氧化应激中起保护作用。由于GSTMl或(和)GSTTI缺失的

  基造成损伤的易感性。GSTMI和GSTTl基因已知可提高对肺癌、膀胱癌、结肠 癌和皮肤癌的易感性,尽管有一些研究相互矛盾“…。GSTMl和GSTTl基因多态 性在关于氧化应激和环境毒素的非癌性病变中也有研究,例如:GSTMl缺失的

  多样硬化病人有更严重的预后,GSTTl缺失个体可提高对Parkinson’S病的危险

  性。由于年老的过程中涉及氧化应激和氧自由基的产生,GST多态性可能在年老 的易感性中起重要作用。最近一项研究表明,与对照组相比,在90岁以上的人口 中发现有较多的GSTTI缺失个体“…。由于GST与噪声和年老造成的听力损伤相 关,推测GsT缺失或联合缺失基因型可提高对噪声性听力损失的易感性。 GsTMl和GSTTl基因缺失型的频率具有明显的种族和地区差异,不同种 族和地区之问GSTMl和GSTTl基因缺失型的频率分别在21%~100%和1 1%~ 64.4%间波动“。“。本研究发现,病例组GSTMl和GSTTl基因缺失型的频率 分别为69.1%和50.8%;对照组GSTMl和GSTTl基因缺失型的频率分别为 56.1%和57.9%,与文献报道的结果相比处于较高的水平。我们的结果表明 GSTMl基因缺失可能是发生噪声性听力损失的易感因素之一,GSTMl可能在 人体对抗噪声性听力损失中起保护作用;而GSTTI与噪声性听力损失的易感性 无关;在增强噪声性听力损失易感性方面,GSTMl和GSTTl基因型之间可能 不存在联合作用。与GSTMI相比,GSTTl无保护作用,一个可能的解释是 GsTMl和GSTTl在噪声和年龄引起的毛细胞损伤进而造成噪声性听力损失中

  内外毛细胞都有组织的分布,而GSTTI在耳蜗组织的分布却未知。GSTMl和

  噪声性听力损失易感性与GSTMl,GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  GSTTI间一个更重要的差别就是GSTMl似乎只在代谢物的联合作用中起作 用,而GSTTl既在代谢物的联合作用中起作用,又可作为代谢物的催化剂。

  酸化合成ATP。线粒体有自己的DNA,称为线粒体DNA(mitochondrial DNA,

  mtDNA)。MtDNA是一个封闭的双链环状分子,人mtDNA有16569bp。MtDNA

  是存在于细胞核染色体之外的基因组,具有自我复制、转录和编码的功能,但 mtDNA没有组蛋白包装“…。线个多肽是呼吸链中的亚基,

  与核基因编码的亚基共同构成呼吸链中5种酶复合物,完成线粒体氧化磷酸化 的产能过程。线粒体DNA与核DNA的不同主要表现在六个方面:①复制的半 自主性;②mtDNA为母系遗传,不遵循孟德尔遗传规律;@mtDNA具有复制

  分离现象;(蛐tDNA具有阈值效应,即当突变的mtDNA达到一定的比例时,

  才有受损的表型出现;(9rntDNA进化率极高”…。MtDNA突变率很高,为核DNA

  的10倍以上,这是因为:①mtDNA缺少组蛋白的保护;②线粒体内无DNA 损伤的修复系统;③线粒体内进行大量氧化过程,产生的自由基可能损伤

  mtDNA。MtDNA的变异有错义突变、蛋白质生物合成基因突变、插入缺失突 变及拷贝数目突变““。

  损失相关的mtDNA突变,Fischel—Ghodsian N5“总结了与听力损失相关的 mtDNA突变,结果见表4—1。感觉神经性听力损失是在mtDNA失调病人中发

  过程中起重要的作用”…,并且有确凿的证据表明mtDNA缺失是年龄依赖性的 ”…。人类心肌研究表明mtDNA缺失的累积性:30岁咀下个体无mtDNA缺失,

  31~40岁25%缺失,41~50岁33%缺失,61~60岁63%缺失,61~70岁75%缺

  失;这些mtDNA缺失至死都在发生并累积。“。线粒体DNA缺失中最常见的是

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  噪声性听力损失易感性与GSTMI,GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  4977bp大片段缺失,mtDNA4977缺失区为nt8483—13459。

  MtDNAnt8470—8482及ntl3447—13459为核苷酸序列完全相同的13bp重复区(5’ 一ACCTCCCTCACCA.3’),缺失发生在这对1 3bp重复区之间,其中nt8470—8482 序列被保留,而m13447—13459序列则随mtDNA4977缺失一同丢失。研究表明 SNHL与mtDNA突变有关,由于mtDNA4977是最常见的一种缺失,并且是在无 家族史的情况下自发,估计自发的SNHL病人中都有mtDNA突变,并且重点 在mtDNA4977缺失。动物研究已发现与进展性听力损失相关的mtDNA4834bp 缺失,且mtDNA4834bp缺失随年龄增长有累积效应5“。鼠mtDNA4834bp缺失 与人mtDNA4977bp缺失类似。Uma Bai…1研究了一个进展性SNHL的家族,10

  个被研究的家族成员都有mtDNA4977缺失,染色体分析均正常,病例听力学和 分子生物学研究表明随着年龄增长而累积的mtDNA4977缺失是感觉神经性听力

  损失的因素之一。Ueda,N”1检测了60个SNHL病例和47个正常对照的 mtDNA4977缺失情况,与对照组相比,SNHL病例组有明显的mtDNA4977缺失率, 并且mtDNA4977缺失率随听力损伤严重程度的升高而升高,说明mtDNA4977缺 失与SNHL的高度相关。 韩维举。’研究发现,长期白噪声暴露后发生永久性阈移的大鼠耳蜗、蜗核 和颞叶脑组织可发生mtDNA4834缺失,其发生率明显高于对照组;而噪声暴露

  组中与听觉无关的颞肌组织mtDNA4834缺失发生很低,与对照组相比差异无显

  著性,提示mtDNA4834缺失与噪声性听力损失有关。鼠mtDNA 4834bp缺失与 人mtDNA 4977bp缺失类似,而关于人mtDNA4977缺失与噪声性听力损失关系 的人群研究国内外均未见报道。根据动物研究的结果推测人mtDNA4”7缺失可 能与噪声性听力损失有关。动物研究的最终目的是为了推导到人群,因此在人 群中进行大规模的病例一对照研究以确定mtDNA4977缺失与噪声性听力损失关 系具有非常重要的意义。 Ueda,N州研究发现SNHL病人mtDNA4977缺失率为75%,高于对照30%, 差异具有统计学意义。关于噪声性听力损失mtDNA4977缺失的其它人群研究未 见报道。我们的研究结果表明:听损组和正常组的mtDNA4977缺失率分别为 95.7%和95.9%,差异不具有统计学意义,不能认为mtDNA4977缺失与噪声性听 力损失相关。由于不可能从活体组织的颞骨中抽提mtDNA进行mtDNA497 7缺

  噪声性听力损失易感性与GSTMl、GSTTI、MtDNA乖CDH23基因多态性研究

  失分析,所以进行白细胞mtDNA4”7缺失分析,但并不能直接反映听觉通路 mtDNA4”7缺失情况。而且在研究对象听力学检测上¨J‘能存在个体误差,影响 研究对象在病例组和对照组问的划分,从而影响最后结论的得出。小的样本量 也会影响得出更客观的结论。噪声性听力损失是受环境和内在个体易感性等多 方面影响的疾病,单基因突变产生的作用是微弱的,因此还需考虑其它基因和 因素进一步研究mtDNA4”7缺失与噪声性听力损失的关系。

  黏附分子(adhesion molecule,AM)是一类介导细胞与细胞、细胞与细胞 外基质黏附作用的膜表面糖蛋白。钙离子依赖的细胞黏附素家族

  噪声性听力损失易感性与GSTMl、GSTTI、MtDNA和CDH23基因多态性研究

  (Ca2+一dependent cell adhesion molecule family.简称钙黏。

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